Objetivo general del proyecto Adecuar RenalTube a las necesidades de los pacientes y mantener su explotación como base de datos clínico-genética y profundizando sobre métodos para el diagnóstico de la acidosis tubular renal distal y estrategias terapéuticas aplicadas a la hipofosfatemia hereditaria ligada al X (XLH). Objetivos específicos del proyecto En coordinación con otros subproyectos de RenalTube, se busca: 

1.  Desarrollar acciones de transferencia destinadas a cubrir las necesidades de los pacientes, en colaboración con las asociaciones que los representan. 
2. Mantener, explotar y fomentar el crecimiento de RenalTube como base de datos clínico-genética de tubulopatías primarias. 
3. En relación con la ATRD, buscar si niños que presentan nefrocalcionosis, litiasis o hipocrecimiento de causa no aclarada, pudiera presentar una situación clínica de ATRD incompleta y, en los padres de niños con ATRD, buscar si existe esta misma situación clínica. 
4. En relación con el XLH, averiguar la función cardíaca en niños con esta tubulopatía y la influencia sobre la enfermedad de estrategias terapéuticas que normalicen los niveles de fósforo sérico.

Investigador principal: Dra. Helena Gil Peña

Institución: Nefrología Pediátrica (Pediatría) – Hospital Universitario Central de Asturias y Universidad de Oviedo.

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LA CAIXA

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http://www.renaltube.com/es/produccion-cientifica/renaltube-pacientes-atrd-xlh/

ANTECEDENTES

La hipofosfatasia (HPP) es una enfermedad genética rara, grave y potencialmente mortal, con una prevalencia estimada en la población europea de 1/300.000 en las formas clínicas más graves y 1/6.370 en las formas clínicas más moderadas (1). En España la prevalencia es desconocida. Esta patología está causada por una o varias mutaciones con pérdida de función en la codificación genética de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNSALP) (2). 

A nivel bioquímico, la HPP se caracteriza por la presencia, de forma persistente, de niveles de actividad de fosfatasa alcalina total por debajo del límite inferior de la normalidad. 

Esto da lugar una deficiente mineralización ósea por alteraciones en la regulación de los fosfatos y del calcio debido a concentraciones elevadas de los sustratos de TNSALP, incluidos pirofosfato inorgánico (PPi) y piridoxal-5’-fosfato (PLP) (forma activa de la vitamina B6). Las elevaciones de PPi extracelular inhiben la mineralización ósea mediante el bloqueo de la formación de cristales de hidroxiapatita, lo que causa una acumulación pronunciada de matriz ósea desmineralizada. TNSALP también desfosforila PLP en piridoxal, lo que le permite cruzar la membrana plasmática hacia el sistema nervioso central. La deficiencia de TNSALP provoca una deficiencia de vitamina B6 en el sistema nervioso central, lo que puede causar convulsiones.

Las manifestaciones clínicas de HPP se asocian con un deterioro progresivo de numerosos órganos vitales, lo que incluye la destrucción y la deformación de los huesos, dolor y debilidad muscular profunda, insuficiencia respiratoria, convulsiones, trastornos renales y anomalías dentales en sus formas más graves que afectan a la población pediátrica (3). El síntoma clásico son las fracturas de estrés recidivantes de predominio en metatarsianos y en ocasiones, la HPP se puede manifestar por pseudofracturas proximales de fémur. 

Hasta la fecha, el diagnóstico de la HPP en la práctica clínica es un reto. Su baja prevalencia dificulta su identificación, especialmente cuando existe un solapamiento con la sintomatología de otras patologías más prevalentes como la osteoporosis o la osteomalacia, lo que puede dar lugar a un tratamiento con medicamentos antirresortivos empeorando sustancialmente el pronóstico de la enfermedad.

Actualmente el diagnóstico de HPP se basa en la detección de niveles disminuidos de fosfatasa alcalina de forma persistente asociados con niveles elevados de los correspondientes sustratos. Una clínica sugestiva de HPP apoyarán el diagnóstico de la enfermedad pudiéndose confirmar mediante el análisis molecular del gen TNSALP (1). Sin embargo, un resultado genético negativo no implica un descarte de HPP en pacientes con bioquímica y clínica compatible. En estos casos, habría que realizar una secuenciación completa del gen para estudiar posibles mutaciones en algunas regiones no codificantes, como el promotor o las regiones intergénicas del gen TNSALP, que no se detectan mediante la secuenciación convencional (4).

Nuestro grupo de investigación ha desarrollado una importante trayectoria en el campo del metabolismo óseo en los últimos años, avalada por numerosos artículos publicados en revistas internacionales de alto impacto. Algunas de las líneas de investigación de este grupo se han centrado en el estudio de las vías de señalización y de regulación del metabolismo óseo en diversas patologías metabólicas poniendo de manifiesto el papel del hueso como órgano endocrino y la conexión entre metabolismo óseo con otras patologías. 

Una de las líneas recientemente incorporadas en el grupo de investigación ha sido la del estudio de enfermedades raras a nivel óseo con resultados prometedores y con gran repercusión a nivel de la población y de la práctica clínica. En el caso de HPP, hemos analizado la utilidad de un algoritmo diagnóstico para evaluar la prevalencia poblacional de esta enfermedad, así como la identificación de posibles diagnósticos omitidos en adultos y población infantil en la provincia de Granada. Estos estudios se han realizado a través de fondos provenientes de Alexion, de la Sociedad Andaluza de Endocrinología, diabetes y Nutrición (SAEDyN) y de la Fundación Española de Investigación Ósea y del Metabolismo Mineral (FEIOMM). 

Los resultados de esta investigación, han causado una gran repercusión mediática ya que hemos demostrado que existe una elevada proporción de la población española sin diagnosticar debido a la inexistencia de un protocolo clínico adecuado para su identificación. Según nuestros datos, la estimación actual de posibles casos de HPP no diagnosticados en España podría alcanzar hasta 15,000 casos. Esto implica que la prevalencia estimada de HPP en nuestro país sería el doble que la publicada anteriormente para Europa (1)(1 /3,100 vs 1 / 6,370). Los resultados de nuestro estudio han sido recientemente publicados en la revista Sci Rep, 2019 (5). Sin embargo, esta proporción podría ser aún mayor, debido al elevado número de pacientes que rehusaron participar en el estudio o no pudieron ser localizados.

Además, en el estudio consideramos sólo las analíticas con datos séricos de fosfatasa alcalina del año 2016, por lo que no se incluyeron en el estudio sujetos potencialmente afectados por no disponer de al menos dos determinaciones analíticas de fosfatasa alcalina. Por otra parte, tanto en el grupo de adultos como en el grupo de población infantil, hubo pacientes con bioquímica y clínica compatibles con HPP pero con resultados genéticos negativos. Esto puede ser debido a que el análisis genético actualmente sólo se lleva a cabo en las regiones codificantes del gen de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNSALP por sus siglas en inglés), y podrían existir mutaciones en las regiones intrónicas que den lugar a una alteración en la actividad del producto proteico final. De hecho, nosotros identificamos una mutación en la región intergénica flanqueante de uno de los exones secuenciados, afectando dicha mutación al procesamiento del RNAm y originando una forma leve de HPP adulta. Debido a sus características clínicas, la HPP podría confundirse erróneamente con osteoporosis u otras enfermedades óseas. 

El tratamiento de estos pacientes con medicamentos antirresortivos es frecuente en los hospitales de atención terciaria, lo que empeora su pronóstico. Por lo tanto, es de vital importancia establecer una evaluación clínica correcta para realizar un diagnóstico adecuado de este trastorno y, por lo tanto, proporcionar el tratamiento adecuado de los pacientes afectados.

1. Mornet E, Yvard A, Taillandier A, Fauvert D, Simon-Bouy B. A molecular-based estimation of the prevalence of hypophosphatasia in the European population. Ann Hum Genet. mayo de 2011;75(3):439-45. 
2. Whyte MP. Chapter 22 - Hypophosphatasia. En: Thakker RV, Whyte MP, Eisman JA, Igarashi T, editores. Genetics of Bone Biology and Skeletal Disease [Internet]. San Diego: Academic Press; 2013 [citado 4 de marzo de 2020]. p. 337-
3. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123878298000226
4. Whyte MP. Hypophosphatasia - aetiology, nosology, pathogenesis, diagnosis and treatment. Nat Rev Endocrinol. abril de 2016;12(4):233-46. 
5. Mentrup B, Girschick H, Jakob F, Hofmann C. A homozygous intronic branch-point deletion in the ALPL gene causes infantile hypophosphatasia. Bone. 2017;94:75-83.
6. García-Fontana C, Villa-Suárez JM, Andújar-Vera F, González-Salvatierra S, Martínez-Navajas G, Real PJ, et al. Epidemiological, Clinical and Genetic Study of Hypophosphatasia in A Spanish Population: Identification of Two Novel Mutations in The Alpl Gene. Sci Rep. 2 de julio de 2019; 9 (1):9569. 

EXPERIENCIA PREVIA DEL INVESTIGADOR PRINCIPAL

El equipo investigador está formado por los miembros del grupo del Dr. Manuel Muñoz Torres (Endocrino Hospital Universitario de Granada y Catedrático de la Universidad de Granada) y de la Dra. Beatriz García Fontana (IP, Hospital Universitario San Cecilio, Ibs.Granada), formado entre otros por Francisco Andújar Vera (Investigador bioinformático, Hospital Universitario San Cecilio, Ibs.Granada), Dr. Iván Iglesias Baena (Investigador colaborador, GenActive Clinic & Research), Dra. Cristina García Fontana (Investigadora, Hospital Universitario San Cecilio, Ibs.Granada).

Este equipo investigador de carácter multidisciplinar está liderado por el Dr. Manuel Muñoz-Torres. En el mismo se incluyen médicos Especialistas en Endocrinología y Nutrición y en Medicina Nuclear, Biólogos, Bioquímicos y Bioinformáticos. La investigadora Beatriz García Fontana es la responsable del área de investigación básica y traslacional. El Dr. Muñoz-Torres y la Dra. García Fontana forma parte del Consorcio CIBER del área temática Fragilidad y Envejecimiento (CIBEFES) del Instituto de Salud Carlos III. 

Este grupo tiene una experiencia acreditada en el estudio de enfermedades que afectan al metabolismo óseo, avalada por los numerosos proyectos conseguidos de forma consecutiva durante los últimos años así como por la significativa producción científica relacionada con el tema del proyecto.

Los miembros del equipo investigador colaboran de forma activa con la asociación AERyOH en su comité científico ligado a la HPP.

HIPÓTESIS

Existen casos infradiagnosticados de HPP por localización de variantes patogénicas localizadas en regiones no codificantes (intrónicas) del gen ALPL, que constituyen alrededor del 80% de la secuencia completa del gen.

OBJETIVOS

- Secuenciación completa del gen codificante de fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNSALP) mediante NGS para detección de mutaciones en las regiones codificantes y no codificantes del gen.

- Cribado de pacientes con sospecha de HPP con genética tradicional (secuencia de la parte codificante) negativa.

- Establecimiento de nuevo diseño secuenciación completa en pacientes con sospecha de HPP sin detección previa de variantes.

- Caracterización de nuevas variantes en localización no codificante del gen ALPL.

POBLACIÓN DE ESTUDIO

Pacientes con sospecha de HPP infantil o adulta, con resultado genético negativo por secuenciación del gen codificante de TNSALP (exclusivamente regiones codificantes) o sin análisis genético, de los que se disponga de muestra de sangre venosa y consentimiento informado, de cualquier procedencia nacional o internacional, que no presenten causas de HPP secundaria.

DESARROLLO

La ejecución del proyecto se realizará mediante reclutamiento de muestras de pacientes afectados procedentes de la asociación AERyOH y de los especialistas endocrinólogos con los que se contacte a nivel nacional. Se extraerá DNA de las muestras sanguíneas para la realización de la secuenciación completa del TNSALP por NGS y posterior análisis e interpretación de los datos por el equipo investigador especializado. Los resultados serán comunicados al paciente a través del especialista. El estudio incluirá un máximo de 192 muestras. 

Las nuevas variantes halladas en la región codificante y no codificante del gen de TNSALP relacionadas con HPP, serán introducidas en la base de datos de la Universidad de Versalles, siendo objeto de publicación científica aquellas que puedan ser de interés para su caracterización completa.

METODOLOGÍA

Tras el estudio de la historia clínica de los pacientes candidatos, se solicitará muestra de sangre a aquellos potencialmente afectados junto a la firma del consentimiento informado para participar en el estudio. Una vez recibidas la muestras de sangre EDTA se procederá a la extracción de ADN genómico siguiendo el protocolo de kit de extracción aportado por proveedor (Qiagen). La muestra extraída, será sometida a análisis de calidad, cantidad e integridad.

Para la secuenciación completa (región exónica e intrónica) del gen de ALP, que consta de casi 70 kbases localizadas en el brazo corto del cromosoma 1, se usará el secuenciador Ion Torrent con el Sistema Ion Chef, disponible en la Plataforma de Genética del Instituto de Investigación Biosanitaria de Granada, siguiendo las instrucciones del fabricante, según el protocolo a elaborar para el equipo Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific): 

Extracción de DNA genómico, generación de la librería mediante rotura enzimática con el Lotus DNA Library Prep kit, y unión de Adaptadores CDI (Combinatorial Dual Index). Captura de las regiones de interés (genes más zona intrónica de fosfatasa alcalina) mediante sondas de captura xGen Lock Down Probes y xGen Capture Gene Pool, estas sondas tienen una longitud de 120b y una Biotina en 5’ para poder enriquecer mediante el uso de Streptavidina unida a una bola magnética. Necesitamos bloquear los adaptadores con Blocking oligos y las regiones de Cot-1 así como un kit de buffers de hibridación y lavados para la captura. Este diseño será puesto a punto para su validación clínica y uno diagnóstico de las muestras a analizar.

El estudio se llevará a cabo en el Hospital Universitario San Cecilio de Granada en coordinación con el Instituto de Investigación Biosanitaria (Ibs.GRANADA), que integra las Plataformas de Genómica, la Unidad de Gestión Clínica de Endocrinología y Nutrición y la Unidad de Análisis Clínicos. Además, en este estudio participará la empresa GenActive Clinic & Research que cuenta con laboratorio propio como clínica sanitaria homologada de apoyo. Todo el equipamiento necesario está disponible en estos centros.

RESULTADOS ESPERADOS

Los estudios genéticos que se realizan actualmente, se limitan a la secuenciación de la parte codificante del gen de TNSALP (en sus 12 exones), por lo que no se identifican mutaciones localizadas en las regiones intrónicas del gen que pueden estar asociadas a HPP, descartando en muchos casos pacientes afectados genéticamente, por no realizar un diagnóstico genético del gen completo. Además, este estudio permitirá establecer la vinculación concreta de cada variante genética descrita con su sintomatología específica, facilitando un abordaje multidisciplinar más dirigido.

Por otro lado, el estudio que se pretende hacer del gen completo, dilucidará si existen otros hallazgos genéticos, como traslocaciones, trasposiciones, duplicaciones o deleciones, que puedan encontrarse a lo largo de la secuencia afectando al gen de ALP.

La carencia de este análisis completo de la secuencia del gen de TNSALP en servicios y unidades de genómica, y la sospecha de existencia de variantes en zonas o regiones no codificantes del gen, hacen del presente proyecto una necesidad clínica para detectar posibles nuevos diagnósticos en pacientes con sospecha a los que se le pueda realizar el seguimiento terapéutico correcto.

Si quieres colaborar con la financiación de este proyecto puedes hacerlo a través de un donativo destinado íntegramente a este proyecto. A continuación te facilitamos los datos para ello:

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CONCEPTO: DONATIVO PARA PROYECTO HPP

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